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Principal Factors of Glycol Chitosan Nanoparticles in In Vivo Tumor-Targeting

나진희 (Na, Jin Hee, 경희대학교 대학원)

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Over the past few decades, various polymeric nanoparticles have been developed for the treatment and diagnosis of tumor. In particular, tumor-targeting nanoparticles have been used to diagnose small-sized cancer tissue to minimize the side effects in normal tissues, and effectively treat tumors; thi...
Over the past few decades, various polymeric nanoparticles have been developed for the treatment and diagnosis of tumor. In particular, tumor-targeting nanoparticles have been used to diagnose small-sized cancer tissue to minimize the side effects in normal tissues, and effectively treat tumors; this maximizes drug concentration in the tumor site. One of the current challenges in cancer therapy is enhancing the tumor-specific targeting of both imaging probes and anticancer agents. However, having a large amount of imaging probes and anticancer agents still produces insufficient tumor accumulation, and this limits their further clinical applications. Moreover, the in vivo characteristics of nanoparticles have been largely unknown, because there are few proper technologies that can achieve the direct and non-invasive characterization of nanoparticles in live animals. Until now, many researchers have been trying to discover the key factors involved in the tumor-targeting of nanoparticles, but they are still largely unknown. Herein, we investigated glycol chitosan-based nanoparticles (CNPs) that can simultaneously execute cancer diagnosis and therapy (cancer theragnosis). Moreover, we tried to analyze key factors of CNPs for tumor-specific targeting. Glycol chitosan is a chitosan derivative with good water solubility. CNPs were synthesized by conjugating hydrophobic 5β-cholanic acids to hydrophilic glycol chitosan. The average size of CNPs was about 300 nm, and near-infrared (NIR) fluorescence dye Cy5.5 was conjugated to it for molecular imaging. Owing to the small size, deformability, fast uptake into tumor cells, and the shielding effect of glycol group, CNPs could be efficiently accumulated within tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect in newly generated tumor vessels. The tumor-targeting ability of CNPs was analyzed in various tumors. In Chapter 2, to improve the in vivo tumor targeting characteristics of polymeric nanoparticles, three glycol chitosan derivatives with different molecular weights (20 kDa, 100 kDa, and 250kDa) were modified with 5β-cholanic acid at the same molar ratio. The glycol chitosan nanoparticles (CNP-20 kDa, CNP-100 kDa, and CNP-250 kDa) were formed under aqueous conditions through self-assembly of amphiphilic glycol chitosan-cholanic acid conjugates. The physicochemical properties of all three CNPs, including degree of substitution with 5β-cholanic acid, surface charge, particle size, and in vitro stability, were similar regardless of molecular weight. Moreover, in vivo biodistribution, time-dependent excretion, and tumor accumulation of CNPs labeled with the NIR fluorescence dye Cy5.5 were monitored in flank tumor-bearing mice, using NIR fluorescence imaging systems. CNPs displayed prolonged blood circulation time, decreased time-dependent excretion from the body, and elevated tumor accumulation with increasing polymer molecular weight. The results collectively suggest that with high molecular weight, CNPs remain for longer periods in the blood stream, thereby leading to increased accumulation at the tumor site. In Chapter 3, we prepared CNPs based on four different degrees (7.5%, 12%, 23%, and 35%) of hydrophobic substitutions (DS) to evaluate their biodistribution and tumor accumulation in vivo. The mean diameters and surface charges of all four CNPs did not differ significantly. However, the stability and deformability of CNPs were dependent upon their DS. By increasing hydrophobic DS, the stability of CNPs increased while the deformability decreased, as measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and filtration tests, respectively. Moreover, NIRF imaging data revealed that CNP-23% circulated in the blood for longer periods of time and displayed higher tumor selectivity as compared to those with lower and higher DS (CNP-7.5%, CNP-12%, and CNP-35%). In the case of CNPs with low DS, CNP-7.5% and CNP-12% were dissociated by proteins in the blood and then mainly excreted by renal clearance due to their low stability. On the other hand, CNPs with high DS, CNP-35%, were captured and degraded in the reticuloendothelial system (RES) mainly by the liver and spleen because of their low deformability. This pharmacokinetic alteration associated with in vivo stability and nanoparticle deformability was observed in both flank and liver tumor-bearing mice models. We proposed that the superior tumor-targeting efficiency of CNP-23% is mainly due to their balanced stability and deformability in vivo. This study demonstrates that the degree of hydrophobic substitution of self-assembled nanoparticles could determine their stability and deformability. In Chapter 4, the goal of this work was to examine the principle factors for in vivo tumor-targeting by investigating the characteristics of our CNPs in various tumor models. We showed that CNPs can be also targeted to tumor tissues in the liver under in vivo conditions. However, the mechanism and key factors of its tumor-targeting ability could still not be fully figured out. We analyzed the key factors for tumor targeting with CNPs in various tumor models. CNP has good deformability to easily move through narrow vessels and capillaries, and good stability to maintain nanoparticle structure during blood flow. Furthermore, the amine groups of CNP can be protonated in tumoral acidic pH, which may result in fast binding and uptake to tumor cells. For precise analysis of these factors, we used three control materials in this study: glycol chitosan polymer (GC), polystylene nanoparticle (PS), and 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine liposome (Liposome). CNP was compared to these control materials in various in vitro and in vivo experiments. We measured zeta potential value of CNP at varied pH (5.5, 6.5, 7.4, and 8.0). The size of CNP did not changed much, but the zeta potential value increased from 8 to 53 mV at pH 8.0 to 5.5, showing the protonation of CNP at an acidic pH. Then, following protonation of CNP to its cellular uptake, we observed the effect of the pH change. In both FACS data and microscopic images, a larger amount of CNP was bound to and entered HT29 tumor cells at an acidic pH. It showed a very fast cellular uptake at pH 6.5 and a lower pH after 2h, which means that the uptake of CNP may become faster at the site of acidic tumor tissues compared to normal tissues. Firstly, we confirmed the high accumulation of CNPs in tumor tissues compared to other organs by long circulation and fast uptake into tumor cells in the flank tumor model. Importantly, the movement of nanoparticles in tumor vasculature was monitored by real-time video imaging. Second, the liver plays a pivotal role in the reticuloendothelial system (RES), a representative immune system for foreign materials. The injected nanoparticles trapped by the liver were fortified by biological ligands to bind to target cells. Moreover, because liver tumors generally cannot be fully removed with surgery, post-diagnosis survival is relatively low. Therefore, targeted imaging or drug delivery is highly necessary, especially in liver tumors. Next, we selected a liver tumor model to analyze the tumor-targeting ability of CNP since liver tumors are difficult to target, even though targeting is clinically important. This model was made by laparotomy and direct injection of HT29 tumor cells into the left lobe of the liver in mice. After intravenous injection of Cy5.5-labeled GC, CNP, PS, and Lipo, their location was analyzed by near infrared fluorescence (NIRF) in vivo imaging technique. CNP showed high accumulation in the liver from 3h post-injection and the NIRF signal became more intense as time went on. PS showed immediate accumulation in the liver, and GC and Lipo did not show significantly high NIRF intensity compared to CNP and PS. The superior tumor-targeting ability of CNP in liver tumor-bearing mice was observed by in vivo/ex vivo NIRF imaging and CyoTEM (Transmission Electron Microscopy). The blood circulation of materials in normal mice was analyzed by measuring the time-dependent NIRF intensity of blood. As expected, fluorescence of PS diminished even 1h post-injection due to its fast entrapment by the liver. During a one-day experiment, CNP showed the longest blood circulation compared to GC and Lipo. About 26.9% of injected CNP still remained in the blood even after one day. This data demonstrates the importance of a stable and deformable nanoparticle structure for long blood circulation, which is essential for EPR-based tumor-targeting. Third, a brain tumor model was selected to show the tumor vasculature-specific targeting mechanism of our nanoparticles that could cross the blood-brain barrier (BBB). Finally, specific detection of metastatic tumors with CNPS was shown in a lung metastasis tumor model. Furthermore, successful optical imaging of unintended secondary metastatic tumors on the forefoot showed the potential for early detection of metastasis in patients. These results demonstrate the utility of fluorescently labeled chitosan nanoparticles in optical imaging of various cancers. Besides, the targeting ability of nanoparticles in the lung metastatic tumor model proved beneficial for advanced clinical applications. Therefore, this study not only shows the tumor-targeting ability of CNP in various tumor models, but also provides valuable information about the tumor-targeting of nanoparticles. Positron emission tomography (PET) images are obtained by tracking positron emitting radioisotopes such as 11C, 18F, 64Cu, and 68Ga in living systems. A principal advantage of PET is that it is the most widely used functional imaging technique in current clinical settings. Molecularly targeted radioisotopes and high sensitivity to PET can provide biological information of the disease. Moreover, PET imaging enables quantitative analysis of the pharmacokinetics and pharmacodynamics of injected molecules with radiolabeling. In Chapter 5, tracking nanoparticles in vivo by microPET contributed toward evaluating the real-time biodistribution of nanoparticles, which provided the quantitative information for optimizing nanoparticles. However, conventional radiolabeling strategies make it difficult to achieve highly specific activities with great efficiency. In this study, we prepared radiolabeled CNPs with highly specific activities via copper-click chemistry. The stable triazole linker between the azide on the CNPs and DBCO made it possible to radiolabel nanoparticles with 64Cu efficiently and with high radiolabeling yield. The quantitative analysis for the 64Cu-radiolabeled CNPs based on the microPET image demonstrated that the 64Cu-radiolabeled CNPs were effectively accumulated into the tumor tissue with a prolonged blood circulation time. These preliminary results suggest that the radiolabeling of nanoparticles using copper-free click chemistry has potential as a facile and is a straightforward method for evaluating in vivo biodistribution and microPET analysis. In this study, we assumed surface property, stability, and deformability as the three key factors for tumor-targeting. Many control groups were compared to CNP, and both in vitro and in vivo experiments were performed for the analysis in this paper. We obtained reasonable answers about the tumor-targeting ability of CNP through this study, and we expect that it will be greatly helpful to research related to nanoparticles for biomedical applications. Moreover, the application of glycol chitosan nanoparticles for diagnosis/therapy may play an important role in the early diagnosis and therapy of cancer.
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본 논문은 종양 진단 및 치료를 위한 글라이콜 키토산 나노입자의 효율 및 응용에 관한 것이다. 지난 수십 년간 종양의 효과적인 진단 및 치료를 위해 다양한 고분자 나노입자가 개발되어 왔다. 특히, 종양 표적화 나노입자를 사용하면, 작은 크기의 암 조직까지도 진단할 수 있으며, 정상 조직에 대한 부작용을 최소화 하고 종양 부위의 약물 농도를 극대화하여 종양을 효과적으로 치료할 수 있다는 장점이 있다. 고분자 나노입자는 다양한 항암제 및 영상 조영제를 함유할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 내에서 오랜 시간 체류하다가 종양 조직에 존재하는...
본 논문은 종양 진단 및 치료를 위한 글라이콜 키토산 나노입자의 효율 및 응용에 관한 것이다. 지난 수십 년간 종양의 효과적인 진단 및 치료를 위해 다양한 고분자 나노입자가 개발되어 왔다. 특히, 종양 표적화 나노입자를 사용하면, 작은 크기의 암 조직까지도 진단할 수 있으며, 정상 조직에 대한 부작용을 최소화 하고 종양 부위의 약물 농도를 극대화하여 종양을 효과적으로 치료할 수 있다는 장점이 있다. 고분자 나노입자는 다양한 항암제 및 영상 조영제를 함유할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 내에서 오랜 시간 체류하다가 종양 조직에 존재하는 느슨한 혈관 벽을 통해 종양 조직으로 침투하고 종양 조직 내에서 오래 머무는 특성 (EPR effect)을 보인다고 알려져 있어, 종양 영상 및 치료를 위한 효과적인 전달체로써 인식되어 왔다. 하지만, 아직까지 고분자 나노입자를 개발하여 뛰어난 종양 표적화 효율을 확인하고, 종양의 진단 및 치료에 응용한 예는 그리 많지 않다. 지금까지 개발된 많은 고분자 나노입자들이 간이나 비장 등 정상 조직에 비특이적으로 축적되어 분해되고 배출되는 거동을 보이며, 종양 표적화 효율은 높지 않은 것으로 보고되어 왔다. 또한 많은 나노입자의 경우 암세포 내로 침투하는 효율이 낮아 치료 효과가 제한되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 생체 적합하고 생분해성 고분자이며 낮은 면역원성을 갖는 글라이콜 키토산 고분자를 기반으로 한 나노입자를 개발하였다. 이렇게 뛰어난 생체 적합성 및 생분해성 때문에 글라이콜 키토산은 다양한 생체의학적 응용을 위하여 사용되어 왔다. 또한, 글라이콜 키토산 고분자의 암 세포특이적 결합, 세포 내 침투 및 분해 거동 때문에 글라이콜 키토산은 종양 치료를 위한 다양한 분야에 응용되어 왔다. 뿐만 아니라 글라이콜 키토산을 분자영상 분야에 응용하여, 종양 및 다양한 질병을 진단할 수 있는 나노 조영제가 개발되었다. 하지만, 대부분의 경우, 개발된 나노 전달체의 생체 내 거동 및 종양 표적화 효율에 대한 평가가 이루어지지 않고 있으며, 간 조직에 축적되는 부작용도 보이고 있다. 본 연구에서는 친수성 글라이콜 키토산 고분자에 소수성 담즙산을 결합시켜 양친성 글라이콜 키토산 복합체를 합성하였다. 개발된 양친성 글라이콜 키토산 복합체는 수용액 상에서 자기 조립을 현상을 보이며, 구 모양의 나노입자를 형성한다. 글라이콜 키토산 나노입자에서는 친수성 글라이콜 키토산 이 외부에 위치하고, 소수성 담즙산이 내부에 위치하게 되는데, 이 때 글라이콜 키토산 고분자는 종양의 표적화를 위한 표적화 인자로 사용되며, 담즙산은 내부에 소수성 약물을 봉입할 수 있는 약물 저장고로 사용될 수 있다. 글라이콜 키토산 나노입자에 근적외선 형광체 (NIRF)를 표지하여 종양 동물 모델 내 종양 표적화 효율을 평가한 결과, 정맥 주사한 이후 상당량의 글라이콜 키토산 나노입자가 종양 부위에 축적됨을 확인하였다. 이와 같은 종양 표적화는 암 조직에 축적되는EPR 효과뿐만 아니라, 생체 내에서의 순환 시간의 연장과 간으로의 낮은 축적율로 인해 종양 모델 내에서 종양 표적화 효율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 글라이콜 키토산 나노입자를 이용하여 종양의 효과적인 치료를 위한 약물전달체의 중요성을 설명하고 다양한 종양 모델에서 글라이콜 키토산 나노입자의 비침습적 생체영상화 (non-invasive in vivo imaging)를 통한 종양의 조기진단 및 글라이콜 키토산 나노입자가 우수한 종양 표적성을 갖는 주요 요인들에 대해 연구하였다. 먼저, 다양한 분자량의 글라이콜 키토산 주쇄를 가진 글라이콜 키토산 나노입자를 합성하였다. 분자량 20k, 100k, 250k 를 가진 글라이콜 키토산을 이용하여 합성한 나노입자들의 생체 내 거동을 관찰한 결과 분자량 250k 글라이콜 키토산 나노파티클이 우수한 종양 표적성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 분자량이 클수록 나노입자가 체외로 배출되는 시간이 느려지면서 보다 안정적으로 체 내 순환을 하게 되며, 이를 통하여 종양에 축적될 수 있는 기회가 많아져 표적능력이 향상된 것으로 사료되었다. 글라이콜 키토산 나노입자의 내부를 형성하는 소수성 담즙산의 비율 (7.5%, 12%, 23%, and 35%)을 달리하여 종양 동물 내 종양 표적화 효율 평가를 실시하였다. 글라이콜 키토산 나노입자의 내부를 형성하는 소수성 담즙산의 비율이 달라지면 글라이콜 키토산에 의한 표면 성질과 크기는 유사하지만 생체 내 안정성 (stability) 및 유연성 (flexibility)이 다른 나노입자들이 만들어지게 된다. 이렇게 합성된 글라이콜 키토산 나노입자를 종양 모델에 적용하여 생체 내 거동을 관찰한 결과 23%의 소수성 담즙산을 컨주게이션한 글라이콜 키토산 나노파티클이 우수한 종양 표적성을 나타냈다. 이 결과를 통해 적절한 소수성 담즙산의 비율을 통해 글라이콜 키토산 나노입자의 안정성 및 유연성을 최적화하는 것이 중요하다는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 이후의 실험은 글라이콜 키토산 분자량 250k, 소수성 담즙산 23%의 글라이콜 키토산 나노입자를 이용하여 진행하였다. 글라이콜 키토산 나노입자의 뛰어난 종양 표적성을 평가하기 위해 나노입자가 아닌 글라이콜 키토산 고분자와 폴리스타일렌 나노입자, 리포좀을 비교실험 하였다. 그 결과, 글라이콜 키토산 고분자의 경우에는 종양으로 축적되지 않고 배출되었다. 폴리스타일렌과 리포좀의 경우 빠른 시간 안에 종양부위 보다는 간으로 축적되는 것이 관찰되었다. 그에 반해, 글라이콜 키토산 나노입자는 뛰어난 종양 표적성을 보였으며, 이는 실시간 분자영상 기술을 이용하여 키토산 나노입자가 종양 조직 내 신생혈관에서 종양 조직으로 축적되는 것을 관찰하였다. 글라이콜 키토산 나노입자의 유연성을 확인하기 위해 시린지 필터 통과 테스트를 시행한 결과 키토산 나노입자가 다양한 포어 사이즈 (0.8, 0.45, 0.2μm)의 시린지 필터를 통과하는 것을 확인하였다. 또한, 글라이콜 키토산 나노입자가 생체 내에서도 안정성을 유지하는지를 테스트한 결과 키토산 나노파티클을 휴먼씨럼알부민버퍼에 녹여 37도씨에서 24시간 처리 후에도 응집되지 않고 안정성을 유지하는 것을 확인하였다. 또한, 글라이콜 키토산 나노입자를 실험 동물에 정맥 주사한 후 시간대 별로 혈액을 체취하여 혈액 내 키토산 나노입자의 거동을 관찰 한 결과 다른 나노입자들 보다 장시간 체 내에서 거동하는 것을 확인하였다. 글라이콜 키토산을 분산시키는 버퍼의 pH 농도 (8.0, 7.4, 6.5, 5.5)를 달리하여 녹인 후 HT-29 세포내 유입을 관찰 한 결과 종양 부위pH와 유사한 약산성 조건 (pH5.5~pH6.5)에서 키토산 나노입자의 아민기가 프로토네이션 됨에따라 키토산 나노입자의 표면이 양전하를 띄게되어 세로내로의 유입이 증가함을 관찰할 수 있었다. 이는 글라이콜 키토산 나노입자가 생체 내 거동 시 종양 조직 내 신생혈관의 수동적 표적지향 효과 (EPR effect) 뿐 아니라 종양 조직의 약산성 환경에서 종양 조직으로의 흡수 및 축적의 효율이 극대화되어 종양 표적능력이 증가되는 것으로 사료된다. 생체 내에는 외부로부터 유입된 물질을 인지하고 이 외부물질을 간으로 보내 빠르게 대사시키는 세망내피계 (RES system)가 존재한다. 이는 종양 표적성을 가지는 나노입자들이 체 내 주입시 외부물질로 인지되어 빠르게 대사되는데 글라이콜 키토산 나노입자는 이러한 의도하지 않은 간으로의 축적량이 매우 적기 때문에 간 내의 종양 조직도 효과적으로 영상화 할 수 있을 것으로 사료되었다. 외과적 시술을 통하여 간 종양 모델을 구축한 후 글라이콜 키토산 나노입자의 종양 표적성을 관찰 한 결과 정상 간 조직에는 키토산 나노입자가 축적되지 않지만 간 조직 중에서도 종양이 생성된 부위에서만 선택적으로 종양 표적성을 보이는 것을 확인하였다. 이는 글라이콜 키토산 나노입자가 체 내 주입시 생체 내의 세망내피계를 효과적으로 피하는 것으로 확인되었다. 종양 동물 모델의 장기를 적출하여 조직 및 세포를 분석한 결과에서도 간 조직의 종양 부위에서만 글라이콜 키토산 나노입자가 관찰되어 정상 간 조직과의 차이를 확인하였다. 종양 표적성이 우수한 글라이콜 키토산 나노입자를 뇌 종양 모델과 폐 전이종양 모델에 적용해 보았다. 뇌 종양 모델에서는 뇌에 종양이 생겨남으로써 뇌의 BBB (Blood-Brain Barrier)가 붕괴되자 키토산 나노입자가 이를 투과하여 종양부위에만 선택적으로 확산되는 것을 확인하였다. 폐 전이종양 모델에서도 다른 장기에 비해 종양이 형성된 폐 부위에서 키토산 나노입자의 축적을 확인할 수 있었다. 또한, 폐 전이를 유발시킨 후 16일 째에는 실험동물 앞 발 부위로의 또 다른 전이가 일어났으며 키토산 나노입자를 통하여 관찰되었다. 이러한 의도하지 않은 종양의 전이를 초기에 관찰하는 것은 임상적으로 큰 의미가 있다고 사료되며 이는 영상화를 통한 종양의 조기진단 가능성을 보여주었다. 형광체를 이용한 영상화는 종양의 위치 추적은 용이하나 정량적 평가는 쉽지 않다. 키토산 나노입자에 임상 적용이 가능한 조영화 성분을 부착시키면 다중영상화 및 정량적 분석이 가능할 것으로 생각되었다. 그러나 기존의 방사선 표지 방법으로는 높은 종양 표적 효율을 관찰하기 어렵다. 본 연구에서는 무동 클릭 화학 (copper-free click chemistry)를 이용하면 방사선 표지 효율이 높아질 것으로 사료되어, 키토산 나노입자에 무동 클릭 화학을 도입 후 PET 조영제인 동위원소 64Cu를 표지하여 PET 영상 및 PET을 이용한 정량분석을 시행하였다. 64Cu를 표지한 키토산 나노입자의 생체 내 거동을 PET을 이용하여 확인한 결과 키토산 나노입자가 장시간 체 순환을 거쳐 종양으로 축적되는 조영 효과를 확인할 수 있었다. 또한 이를 이용하여 키토산 나노입자의 각 장기별 분포를 정량분석 하였다. 이렇게 무동 클릭 화학 표지방법을 이용하면 방사선 표지 효율을 높일 수 있으며, 기존의 방법보다 쉽게 나노입자 및 조영제의 정량분석적 평가가 가능할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 종양 표적 능력을 가진 글라이콜 키토산 나노입자가 생체 내에서 종양 표적성에 영향을 미치는 요인들에 대해서 관찰하였으며, 그 결과 글라이콜 키토산 나노입자의 생체 내 안정성 (stability), 유연성 (flexibility) 및 표적 종양으로의 빠른 유입이 키토산 나노입자가 우수한 종양 표적성을 갖는 주요 요인으로 확인되었다. 이는 키토산 나노입자가 종양 진단에 이용되는 다중화 영상의 조영제로 응용 및 종양 치료용 약물 전달체로의 사용 가능성을 확인하였다.
목차 moremore
Chapter 1. Introduction 1
1.1. Nanomedicine in cancer. 2
1.1.1. Passive targeting 3
...
Chapter 1. Introduction 1
1.1. Nanomedicine in cancer. 2
1.1.1. Passive targeting 3
1.1.2. Active targeting. 5
1.2. Glycol chitosan nanoparticles in cancer. 5
1.3. Research rationale 8
1.4. References. 9
Chapter 2. Effect of polymer MW on tumor targeting characteristics of glycol chitosan nanoparticles in tumor-bearing mice 15
2.1. Introduction 16
2.2. Materials and methods. 17
2.2.1. Materials 17
2.2.2. Acid degradation of glycol chitosan 17
2.2.3. Synthesis of glycol chitosan-5β cholanic acid conjugates 18
2.2.4. Physicochemical characterization of glycol chitosan nanoparticles. 18
2.2.5. Tissue distribution and tumor accumulation of glycol chitosan nanoparticles. 19
2.2.6. Non-invasive NIR fluorescence imaging of glycol chitosan nanoparticle. 20
2.2.7. Statistics 21
2.3. Results and discussion 21
2.4. Conclusion. 37
2.5. References. 37
Chapter 3. Effect of degree of hydrophobic substitution of self-assembled glycol chitosan nanoparticles on tumor targeting characteristics. 41
3.1. Introduction 42
3.2. Materials and methods. 43
3.2.1. Materials 43
3.2.2. Synthesis of glycol chitosan-cholanic acid conjugates. 44
3.2.3. Physicochemical characterization of glycol chitosan nanoparticles. 44
3.2.4. Stability test of glycol chitosan nanoparticles using SDS-PAGE. 45
3.2.5. Deformability of glycol chitosan nanoparticles 46
3.2.6. Non-invasive NIR fluorescence imaging of glycol chitosan nanoparticles. 46
3.2.7. Biodistribution and tumor accumulation of glycol chitosan nanoparticles. 47
3.3. Results and discussion 47
3.4. Conclusion. 63
3.5. References. 64
Chapter 4. Key factors of glycol chitosan nanoparticles for in vivo tumor-targeting. 68
4.1. Introduction 69
4.2. Materials and methods. 70
4.2.1. Materials 70
4.2.2. Fabrication of Cy5.5 labeled nanoparticles. 71
4.2.3. Morphological shapes and size distribution of nanoparticles. 72
4.2.4. Deformability (Filtration) test of nanoparticles using syringe filters 72
4.2.5. In vitro stability test of nanoparticles using SDS-PAGE. 73
4.2.6. In vitro stability test using DOX loaded CNPs and DOX loaded PC-liposome. 73
4.2.7. Flow cytometry analysis 74
4.2.8. In vitro cellular uptake of CNPs 74
4.2.9. Tumor models 74
4.2.10. Intravascular live imaging of nanoparticles in tumor vasculature 76
4.2.11. Tissue staining and histological analysis. 77
4.2.12. Cryo TEM and CLEM (Corelative light-electronic microscope) analysis. 77
4.2.13. Statistical method 78
4.3. Results. 78
4.4. Discussion 105
4.5. Conclusion. 108
4.6. References. 109
Chapter 5. Facile 64Cu radiolabeling method of glycol chitosan nanoparticles via copper-free click chemistry for micoPET imaging 115
5.1. Introduction 116
5.2. Materials and methods. 118
5.2.1. Materials 118
5.2.2. Synthesis of azide-functionalized CNPs (CNP-N3) 119
5.2.3. Synthesis of DBCO-PEG4-Lys-DOTA 120
5.2.4. Pre-radiolabeling: 64Cu-DOTA-Lys-PEG4-DBCO complex. 122
5.2.5. Post-conjugation: Radiolabeling of CNP-N3 with 64Cu-DOTA-Lys-PEG4-DBCO. 123
5.2.6. In vitro NIRF imaging of Cy5-CNPs in flank tumor-bearing mice. 124
5.2.7. microPEG imaging: Biodistribution and pharmacokinetics of 64Cu-CNPs. 124
5.3. Results. 125
5.4. Discussion 139
5.5. Conclusion. 144
5.6. References. 145
Chapter 8. Summary (Korean). 150