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Brassinin suppresses the growth of human lung cancer and chemosensitizes to paclitaxel in xenograft mouse model through the suppression of STAT3 signaling pathway

세포모델과 이종이식 생쥐모델을 활용한 Brassinin의 STAT3 신호경로 조절을 통한 폐암세포 성장 억제 및 파클리탁셀에 대한 화학적민감성 증가 검증

이종현 (Lee, Jong hyun, 경희대학교 일반대학원)

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STAT3는 전사조절인자로서 다양한 암 세포주에서 세포의 성장, 생존, 증식, 전이, 신생 혈관형성에 밀접하게 관련되어있는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 Brassinin이 폐암세포에서 STAT3의 활성을 억제함으로써 항증식 효과 및 세포사멸사 유도 효능에 대한 연구를 진행하였으며, 더 나아가 폐암세포를 면역 억제된 누드 마우스에 이종 이식하여 Brassinin에 의한 항암 효과를 평가하였다. Brassinin이 염증성 사이토카인 IL-6에 의해 유도된 STAT3 활성을 억제하는 것을 확인 할 수 있었고, 또한 ...
STAT3는 전사조절인자로서 다양한 암 세포주에서 세포의 성장, 생존, 증식, 전이, 신생 혈관형성에 밀접하게 관련되어있는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 Brassinin이 폐암세포에서 STAT3의 활성을 억제함으로써 항증식 효과 및 세포사멸사 유도 효능에 대한 연구를 진행하였으며, 더 나아가 폐암세포를 면역 억제된 누드 마우스에 이종 이식하여 Brassinin에 의한 항암 효과를 평가하였다. Brassinin이 염증성 사이토카인 IL-6에 의해 유도된 STAT3 활성을 억제하는 것을 확인 할 수 있었고, 또한 Brassinin이 SOCS-3 단백질을 감소시키며 PIAS-3의 경우 단백질과 mRNA 모두를 증가시켰다. siRNA를 활용한 PIAS-3의 knockdown은 Brassinin에 의한 STAT3와 세포독성을 억제함을 보여주었다. 또한 Brassinin을 처리한 세포에서 SOCS-3의 과발현은 STAT3 인산화와 세포 생존을 증가시켰다. Brassinin은 STAT3에 의해 조절되는 다양한 유전자들뿐만 아니라 폐암세포의 성장, 전이를 억제시켰고 세포자멸을 유도하였다. 더욱이, 기존에 항암제로 널리 사용되고 있는 파클리탁셀과 병용 처리 시 폐암세포가 이식된 면역억제 생쥐에서 생성된 암의 크기를 감소시켰고, 종양 조직에서 p-STAT3, Ki-67, CD31 등의 단백질 또한 감소함을 확인 할 수 있었다. 모든 결과를 종합하여 볼 때, Brassinin이 PIAS-3와 SOCS-3의 조절을 통해서 STAT3 신호 경로를 차단하고, 이를 통해 세포 성장을 약화시키고 파클리탁셀의 민감성을 극대화 시킴을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 통해 폐암의 치료를 위해 Brassinin과 파클리탁셀의 병용치료가 새로운 방법이 될 수 있음을 제안하고자 한다.
초록 moremore
Persistent phosphorylation of signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3) is frequently observed in tumor cells. In the present study, brassinin (BSN) suppressed both constitutive and the IL-6-inducible STAT3 activation in lung cancer cells. Moreover, BSN induced PIAS-3 at the prote...
Persistent phosphorylation of signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3) is frequently observed in tumor cells. In the present study, brassinin (BSN) suppressed both constitutive and the IL-6-inducible STAT3 activation in lung cancer cells. Moreover, BSN induced PIAS-3 at the protein and mRNA levels, whereas the expression of SOCS-3 was reduced. Knockdown of PIAS-3 by small interfering RNA prevented inhibition of STAT3 and cytotoxicity by BSN. Overexpression of SOCS-3 in the BSN-treated cells increased STAT3 phosphorylation and cell viability. BSN down-regulated STAT3-regulated gene products, inhibited proliferation and invasion, and induced apoptosis. Most importantly, when administered intraperitoneally, combination of BSN and paclitaxel significantly decreased the tumor development in a xenograft lung cancer mouse model associated with down-modulation of phospho-STAT3, Ki-67 and CD31. These results suggest that BSN inhibits STAT3 signaling through modulation of PIAS-3 and SOCS-3, thereby attenuating tumor growth and increasing sensitivity to paclitaxel.
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Figure Contents iv
Abbreviation v
Abstract vi
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Figure Contents iv
Abbreviation v
Abstract vi

I. Introduction 1
II. Materials and Methods 3
1) Reagents 3
2) Cell lines and culture conditions 3
3) Western blot analysis 4
4) EMSA for STAT3-DNA binding 4
5) Immunocytochemistry for STAT3 localization 5
6) Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 5
7) Transfection of plasmids 6
8) MTT assays 6
9) Live and dead assays 6
10) Monitoring of cell growth with the RTCA DP Instrument 7
11) Invasion assays 7
12) Cell cycle analysis 8
13) Annexin V assays 8
14) Combination therapy studies 8
15) Animal study 9
16) Subcutaneous implantation of A549 cells 9
17) Experimental protocol 9
18) Western blot analysis for tumor tissues 10
19) Immunohistochemical analysis of NSCLC tumor samples 10
20) Statistical analysis 11

III. Results 12
1) BSN specifically inhibits constitutive STAT3 activation in A549 cells, but not in U266, DU145, K562, and SCC4 cells. 12
2) BSN specifically inhibits constitutive STAT3 activation in A549 cells, but not in other human lung cancer cell lines. 12
3) BSN reduces constitutive STAT3 phosphorylation in a concentration-dependent manner. 13
4) BSN inhibits binding of STAT3 to the DNA. 13
5) BSN reduces nuclear pool of STAT3 in NSCLC cells. 13
6) BSN suppresses constitutive activation of JAK1, JAK2, and Src. 16
7) BSN inhibit constitutive activation of ERK and Akt. 16
8) BSN inhibits the IL-6-induced STAT3 and ERK phosphorylation. 16
9) BSN-induced inhibition of STAT3 phosphorylation is reversible. 16
10) BSN induces the expression of PIAS-3 and attenuates the expression of SOCS-3 in A549 cells. 17
11) Silencing of PIAS-3 or overexpression of SOCS-3 in BSN-treated cells reverse the effect of BSN on STAT3 activity and cell viability. 21
12) Overexpression of STAT3 attenuates the BSN-mediated apoptosis. 22
13) BSN suppresses cell proliferation in human lung cancer cells. 26
14) BSN suppresses lung cancer cell invasive ability. 26
15) BSN causes the increased accumulation of the cells in the sub-G1 phase in A549 cells. 26
16) BSN promotes apoptotic cell death in A549 cells. 26
17) BSN activates Caspase-3 and causes PARP cleavage. 26
18) BSN regulates the expression of various proteins involved in apoptosis. 27
19) BSN enhances the effect of paclitaxel on induction of apoptosis in NSCLC cells. 30
20) BSN potentiates the antitumor effect of paclitaxel in a xenograft lung cancer mouse model. 33
21) BSN suppresses the growth of human NSCLC and inhibits STAT3 activation in the in vivo xenograft model. 36
22) BSN suppressed the activation of transcription factor STAT3 in NSCLC tumor tissues. 36
23) BSN inhibited the STAT3-regulated gene products in NSCLC tumor tissues. 37

IV. Discussion 41
V. References 45